導(dǎo)讀

在科研圈，Western blot（WB）堪稱“實(shí)驗(yàn)玄學(xué)”——條帶忽明忽暗、背景臟如馬賽克、分子量對(duì)不上……好不容易做出結(jié)果，卻因圖片不合格被期刊拒稿？別慌！今天手把手教你從“WB新手”變“條帶達(dá)人”，輕松拿捏符合期刊要求的“神仙條帶圖”！ ?

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：避坑第一步

? 你真的懂“對(duì)照”嗎？

- 陽(yáng)性對(duì)照（證明體系可行）、陰性對(duì)照（排除非特異性結(jié)合）、內(nèi)參對(duì)照（校正上樣量）缺一不可！ ?

- 舉例：研究腫瘤蛋白表達(dá)，記得同時(shí)測(cè)癌組織（陽(yáng)性）、正常組織（陰性）、β-actin內(nèi)參。 ?

**劃重點(diǎn)**：沒有對(duì)照的WB=“自說(shuō)自話”，期刊編輯秒拒沒商量！?

二、樣本制備：細(xì)節(jié)控的自我修養(yǎng)

? 蛋白提取3大雷區(qū)，千萬(wàn)別踩！

① 暴力提取=蛋白碎一地

超聲/研磨時(shí)控制強(qiáng)度，避免蛋白降解（尤其脆性樣本）。

② 濃度測(cè)定擺爛=條帶忽胖忽瘦

用BCA/Bradford法精確測(cè)濃度，上樣量誤差≤5%！

③ Loading Buffer沒煮透=高分子量“拖尾”

95℃煮樣5-10分鐘，離心后取上清，別偷懶！ ?

三、電泳與轉(zhuǎn)膜：承上啟下的“技術(shù)活”

? 電泳：選對(duì)膠，條帶分分鐘“站隊(duì)”

- 小分子蛋白（<20kD）：12%-15% SDS-PAGE膠，跑快一點(diǎn)（電壓≥80V，避免擴(kuò)散）。 ?

- 大分子蛋白（>100kD）：8%-10%膠，低電壓慢跑，防止“卡膠”。?

? ?轉(zhuǎn)膜：膜選不對(duì)，前功盡棄！

- PVDF膜：疏水強(qiáng)，適合>20kD蛋白，用甲醇活化30秒。 ?

- NC膜：親水好，適合<20kD蛋白，但易脆易漏。?

四、抗體孵育：抗體選對(duì)，條帶自帶“高光”

? 抗體避坑指南

- 一抗：認(rèn)準(zhǔn)“驗(yàn)證過的應(yīng)用”（比如明確標(biāo)注“WB適用”，別買“科研盲盒”）。 ?

- 二抗：種屬匹配是底線（小鼠一抗配抗小鼠二抗，HRP/AP標(biāo)記按需選）。 ?

五、顯色成像：捕捉條帶的“決定性瞬間”

① 成像設(shè)備

選擇拍照速度快，信噪比高的設(shè)備。

② 曝光策略

先短后長(zhǎng)（避免過曝，保留背景灰度值≤25%）。

六、圖片處理：美化≠造假，這3步可做！

? 允許的操作：

- 裁剪白邊（突出條帶區(qū)域） ?

- 統(tǒng)一亮度/對(duì)比度（全局調(diào)整，禁止局部P圖！） ?

- 標(biāo)注分子量Marker（用箭頭/數(shù)字清晰標(biāo)出） ?

? 絕對(duì)禁止：

- 復(fù)制粘貼條帶（期刊查重系統(tǒng)能掃出來(lái)?。??

- 抹除背景雜點(diǎn)（真實(shí)數(shù)據(jù)比“完美”更重要）

七、期刊要求：投稿前的“最后安檢”

? 必查清單：

- 分辨率：300dpi及以上（tiff格式優(yōu)先） ?

- 條帶順序：與實(shí)驗(yàn)描述完全一致（從左到右標(biāo)清樣本編號(hào)） ?

- 圖注規(guī)范：包含抗體名稱、稀釋度、內(nèi)參信息（例：β-actin, 1:1000）?

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